芽胞杆菌是一种重要的工业微生物生产菌株，目前广泛用于多种生物化学品的工业生产。然而，高效遗传操作工具的缺乏阻碍了芽胞杆菌的开发和应用推广。近日，我室陈守文教授实验室研究人员在地衣芽胞杆菌中建立了基于CRISPR-Cas9 nikcase的高效基因组编辑工具，相关文章“Development of an Efficient Genome Editing Tool inBacillus licheniformisUsing CRISPR-Cas9 Nickase“于2018年1月12日发表在杂志Applied and Environmental Microbiology上。

目前，基于II-A型CRISPR / Cas9系统的基因组编辑系统主要分为两类：Cas9介导的基因组编辑和Cas9nickase（Cas9n）介导的基因组编辑系统。之前的研究表明，Cas9对部分细菌宿主具有较强的毒性，相比之下，Cas9n的应用可更有效的避免毒性导致的致死效应。本文中，研究人员以地衣芽胞杆菌DW2为出发菌株，将含有D10A突变位点的Cas9n整合至DW2基因组上，然后将gRNA表达框和同源臂放在同一个质粒上。借助CRISPR/Cas9n系统，使用长1.0kb的同源臂进行敲除时，基因yvmC的编辑效率高达100%。随后，研究人员针对同源臂长度进行了优化，除了1.0kb的同源臂外，还验证了长为0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.5kb、0.7kb分别对基因编辑效率的影响。结果表明，随着同源臂的截短，编辑效率随之降低，其中0.1kb条件下的编辑效率约为51.4%，1.0kb的编辑效率最高。之后，研究人员又验证了双基因的敲除效率为11.6%；并以79.0%的效率实现了长约42.7 kb的大片段的删除。除了上述的单基因敲除、双基因敲除和大片段敲除，研究人员还验证了外源基因的整合，实现了枯草芽胞杆菌来源的纳豆激酶基因aprN以76.5%的效率整合至地衣芽胞杆菌DWc9n基因组上，并成功表达。最后，研究人员还将CRISPR/Cas9n系统应用于异源蛋白表达宿主菌的改造中，他们使用该系统成功敲除了地衣芽胞杆菌DWc9n中的六个胞外蛋白酶基因和杆菌肽合成基因簇，获得了宿主菌DWc9nD7，并将纳豆激酶的表达质粒pP43SNT-SsacC分别导入DWc9nD7和DWc9n中。 发酵结果表明，菌株DWc9nD7/pP43SNT-SsacC的纳豆激酶活力可达59.7 FU/mL，相比对照菌株DWc9n/pP43SNT-SsacC提高25.7%。

本文中借助CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌中成功实现了单基因敲除、多基因敲除、大片段敲除和单基因整合，在芽胞杆菌中建立了快速高效的基因组编辑工具。本文的研究将有助于芽胞杆菌产业的技术开发和产业推广。

链接：

http://aem.asm.org/content/early/2018/01/08/AEM.02608-17.abstract?sid=46060c3a-46dd-4d3f-8843-2002672ef381